定量測試方法主要應(yīng)用于藥物、食品、化工等行業(yè),用于定量測定某一特定物質(zhì)或多種物質(zhì)。在選擇物質(zhì)定量分析方案時,需要考慮多種關(guān)鍵因素,如樣品體系、目標物的性質(zhì)、樣品矩陣、靈敏度和檢出限、準確度和精密度、分析速度和成本,操作難度等。以上因素眾多,故選擇合適的定量分析方法尤其重要。
定量是指利用檢測器的響應(yīng)信號(色譜,光譜峰面積或峰高)與待測組分的量(質(zhì)量或濃度)成正比定量。
有機目標物定量可按照下圖選擇定量方案:
儀器方案定好后,為了定量更準確,還需要選擇一種或多種適合目標化合物定量分析的方法,在實際操作中,最好對比不同方法的優(yōu)缺點,并根據(jù)實驗結(jié)果進行調(diào)整和優(yōu)化。
常見的定量分析方法有:歸一化法、外標法、內(nèi)標法、標準加入法等。
一、 歸一化法
將所有出峰組分的含量之和按100%計的定量方法,稱為面積歸一法。
歸一法使用時需要滿足三個條件
1、樣品中所有組分都能從色譜柱流出
2、所有組分都能被檢測器檢出
3、能測定或查出所有組分相對校正因子
各組分含量的計算公式如下:
式中:C:含量 F:校正因子 A:表示峰面積
若樣品中各組分的校正因子相近,可將校正因子消去,當樣品中組分是同分異構(gòu)體或同系物,Fi都很相近。
在計算時通常采用公式如下:
案例1 : 當樣品主成分含量大于50%面積歸一定量結(jié)果如下圖
圖2 丙酮GC-FID純度分析
外標法又稱標準曲線法。取待測組分的純物質(zhì)配成一系列不同濃度的標準溶液進行色譜分析,繪制峰面積與標樣含量的標準工作曲線,并擬合二者的線性方程式。
在計算時通常采用公式如下:
案例2:目標物標準品,用外標法定量時結(jié)果如下圖
圖3 測樣品中對二甲苯的準確含量,上圖為標準曲線
目前微譜已經(jīng)積累的成熟外標定量方法見表1
表1 化合物外標法定量典型案例表
選擇適宜的純物質(zhì)作為內(nèi)標物,準確稱量后加入待測樣品中,根據(jù)組分和內(nèi)標峰面積的比值以及內(nèi)標加入量進行定量。
在計算時通常采用公式如下:
內(nèi)標物是原樣品中不含有的組分,否則會使峰重疊而無法準確測量內(nèi)標物的峰面積。
內(nèi)標物的保留時間應(yīng)與待測組分相近,但彼此能分離(R≥1.5)。
內(nèi)標物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。
內(nèi)標物需要準確稱量,其加入量要與被測組分的含量接近。
案例3:內(nèi)標標準品,為了排除樣品基質(zhì)干擾,用內(nèi)標法定量時結(jié)果如下圖
標準加入法又稱疊加法,實際是一種特殊的內(nèi)標法。以待測組分的純物質(zhì)為內(nèi)標物,加入到待測樣品中,然后在相同的色譜條件下,測定加入內(nèi)標物前后待測組分的峰面積,從而計算待測組分的含量。
在計算時通常采用公式如下:
標準加入法每一個樣品都要配制三個以上的、含樣品溶液和標準溶液的混合溶液,因此,這種方法不適于大批樣品的分析。在難以找到合適內(nèi)標物時,可作為內(nèi)標法的一種延伸。
定量分析要求目標組分都必須分離,能被檢測器檢測到,并且濃度在檢測器的線性范圍內(nèi),不同方法適用于不同要求。
圖5 定量方法選擇導(dǎo)圖
外標法是所有定量方法的基礎(chǔ),可以精確進樣量的情況下,常規(guī)分析通常都采用外標法。
歸一化法不要求精確進樣量,但要求所有組分都必須出峰,或者所有出峰組分的總含量已知。歸一化法也可用于外標法定量后,對總量進行歸一化誤差修正。
內(nèi)標法的關(guān)鍵是要能夠找到合適的內(nèi)標物。內(nèi)標法的稱量引起的誤差小于色譜正常定量分析誤差,內(nèi)標和目標物結(jié)構(gòu)差異大時常需要校正。
標準加入法常用來輔助判定假陽性,這種方法可以消除基體干擾。
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